دانلود پایان نامه ارشد درباره خير، آنزيم، انتهاي، پلاسميد

محققيني از دانشگاه كاليفرنيا و موسسه جانور شناسي دانشگاه باسل، از ريزماهواره ها بعنوان ردياب براي بررسي رفتار آميزشي گروهي از شمپانزه هاي وحشي در جنگلي خاص استفاده نمودند. اين محققين موهاي باقيمانده در آشيانه هاي موقت موجود در نوك درختان كه حيوانات در آنها مي خوابيده اند را جمع آوري كرده و DNA را از ريشه موها استخراج نمودند. با مقايسه الگوي انگشت نگاري ريزماهواره اي ماده ها و نرهاي بالغ و 13 بچه دريافتند كه 7 بچه متعلق به نرهاي اين گروه نمي باشند. بنابراين حداقل برخي از شامپانزه هاي ماده مي بايستي در طي شب به جنگل هاي مجاور رفته و با نرهايي از گروه هاي ديگر برخورد نموده باشند (اگرچه اين محققين هرگز چنين چيزي را مشاهده نكرده بودند). چنين ماجراهايي مي تواند توضيح دهد كه چگونه حتي گروه هاي كوچك از شمپانزه ها مي توانند به ميزان زيادي تنوع ژنتيكي خود را حفظ نمايند (Kotlik and Berrebi, 2001).
Luikart و همكارانش (1998) با استفاده از تئوري ژنتيك جمعيت و شبيه سازي رايانه اي، روشي گرافيكي را براي تشخيص جمعيت هاي گردن بطري87 ابداع كرده اند. اينها جمعيت هايي هستند كه به تازگي دچار كاهش شديد در اندازه شان شده اند. اين كاهش شديد مي تواند آثار زيانباري داشته و از توانايي تكاملي چنين جمعيت هايي بكاهد و بدين ترتيب احتمال انقراض شان را افزايش مي دهد. از اينرو تشخيص بموقع اين وضعيت و اتخاذ تدابيري ويژه، مي تواند از انقراض اين جمعيت ها جلوگيري نمايد. محققين مذكور دريافتند كه بروز حالت فوق موجب انحرافي خاص در توزيع فراواني هاي آللي مي گردد به نحوي كه آلل هاي با فراواني كم در مقايسه با آلل هاي با فراواني متوسط كمتر مي شوند. آنها 8 تا 10 جايگاه ريزماهواره اي را در هر گونه انتخاب كرده و هيستوگرام توزيع فراواني اين جايگاه ها را براي حدود 30 فرد رسم و با هيستوگرام مبنا براي جمعيت هاي گردن بطري مقايسه كردند و موفق شدند با دقت زيادي جمعيت هاي در حال انقراض88 را شناسايي نمايند (Luikart et al., 2003). 1-3-1-10- تشخيص آلل هاي ريزماهواره اي
اين نشانگرها نيز همانند ساير نشانگرهاي مبتني بر PCR، از اين طريق تكثير شده و فرآورده هاي حاصله پس از الكتروفورز تشخيص داده مي شوند. تكثير ناحيه مورد نظر با استفاده از يك جفت آغازگر كه مكمل قسمتي از رديف هاي پهلويي ناحيه تكرارشونده مي باشند، صورت مي گيرد. اين رديف ها كاملا اختصاصي مي باشند و در ژنوم كامل تنها يكبار رخ مي دهند. بنابراين حتي اگر در ريزماهواره اي خاص واحد تكرارشونده در چندين محل متفاوت در ژنوم روي دهد، PCR تنها يك محل را تكثير خواهد كرد (محلي كه داراي رديف هاي پهلويي متناظر با آغازگرهاي مربوطه مي باشد). طول فرآورده PCR مطابق با تعداد واحد تكرارشونده در آن محل متفاوت است. الكتروفورز بايد به گونه اي باشد كه امكان تشخيص باندهايي كه تنها به اندازه ي يك باز متفاوتند را بوجود آورد. انحصاري بودن آغازگرها موجب مي شود كه در هر فرد تنها يك يا دو باند (در فرد هتروزيگوت دو باند و در فرد هموزيگوت يك باند) بدست آيد (نقوي و همکاران، 1384). شكل 1-7 طرحي از اين حالت را نشان مي دهد.
8
7
6
5
4
3
2
1
شكل1-7- نمايي از تنوع ريزماهواره اي كه بوسيله آغازگرها يا بوسيله يك كاوشگر كه براي يك تك جايگاه ابداع شده است، تشخيص داده مي شود.
در اين شكل 7 آلل ديده مي شود. ستون 8، الگوي مربوط به يك فرد هموزيگوت را نشان مي دهد. ساير ستون ها ژنوتيپ هاي هتروزيگوت را نشان مي دهند.
پس از الكتروفورز سه راه براي نمايان سازي آلل ها وجود دارد:
1- نشاندار كردن با آغازگرهاي راديواكتيوي يا استفاده از نوكلئوتيدهاي نشاندار. هر دو راهكار موجب مي شوند كه فرآورده PCR نشاندار شود. بنابراين اين فرآورده ها را مي توان بر روي فيلم هاي حساس به اشعه ايكس نمايان ساخت. اين روش عليرغم دقت زياد، بدليل بهره گيري از مواد راديواكتيو و خطرات ناشي از آن به تجهيزات ويژه نياز داشته وتنها در آزمايشگاه هاي مجهز قابل انجام است (Hansen et al., 1995).
2- نشانداركردن فلورسنتي آغازگرها و سپس استفاده از سيستم رديف يابي خودكار89. بدين ترتيب توالي قطعه تكثير شده تعيين مي شود و در نتيجه تعيين دقيق اندازه آلل امكان پذير مي گردد. اين روش دقيق ترين روش موجود مي باشد ولي تجهيزات مورد نياز آن بسيار گران بوده و در هر آزمايشگاهي وجود ندارد (Hansen et al., 1995).
3- استفاده از رنگ آميزي هاي ويژه مانند رنگ آميزي نيترات نقره90 كه بسيار حساس بوده و مقادير بسيار جزئي DNA را نيز نمايان مي سازد. سادگي و سهولت كاربرد اين روش، كارآمدي برابر با ساير روش ها، ارزان بودن، امكان استفاده از آن در هر نوع شرايط آزمايشگاهي و حساسيت بسيار بالا از برتري هاي اين روش مي باشند (Bouhadad et al., 2002). خصوصيات برخي از نشانگرهاي DNA در جدول 1-1 آمده است.
جدول 1-1 -مقايسه خصوصيات چند نشانگر DNA(فياضي، 1385)
مبناي مقايسه
ALP
PBR
RFLP
RAPD
AFLP
Microsatellite
چگونگي كاربرد
خيلي سريع
سريع
كند
خيلي سريع
آهسته
خيلي سريع
سلامتي
مطمئن
مطمئن
مواد راديو اكتيو
مطمئن
ژل پلي اكريلاميد
ژل پلي اكريلاميد
تكرار پذيري (درصد)
تقريبا 100
تقريبا 100
تقريبا 95
متوسط
بالا
تقريبا 100
كيفيت DNA
پايين
پايين
بالا
بالا
بالا
پايين
كميت DNA
پايين
پايين
بالا
پايين
پايين
پايين
نياز به دانستن توالي
بله
بله
خير
خير
خير
بله
تشخيص جهش نقطه‌اي
خير
بله
مشكل
خير
خير
خير
ميزان چند شكلي
پايين
بالا
بالا
بالا
پايين
بالا
فنوتيپ مولكولي
همبارز
همبارز
همبارز
غالب
همبارز
همبارز
نياز به موجود زنده
خير
خير
بله
خير
خير
خير
1-3-1-11- ناقل91
ناقل در واقع يک مولکول DNA مي باشد که مي تواند در بدن ميزبان92 همانندسازي93 کند. ناقل ها بايد داراي ويژگي هاي بنيادي براي کار در مهندسي ژنتيک باشند. در حالت ايده آل ناقل ها بايد مولکول هاي DNA به نسبت کوچکي باشند که جداسازي و کار با آنها را آسان کند. آنها بايد داراي يک منشا همانندسازي94 باشند، براي اينکه امکان رونويسي از DNA آنها در هنگام رشد و تقسيم سلولي ميزبان وجود داشته باشد. وجود نشانه اي گزينش پذير95 که براي رديابي ناقل لازم است، يکي از ويژگي هاي بهينه ي آن است. بعلاوه داشتن حداقل يک محل برش آنزيم هاي محدودالاثر الزامي است، زيرا وارد کردن ناقل به DNA ديگري را در هنگام توليد DNA نوترکيب امکان پذير مي سازد (سمرباف، 1385). 1-3-1-11-1- پلاسميد96
پلاسميدها مولکول هاي DNA دو رشته اي حلقوي هستند که از DNA کروموزومي سلول جدا مي باشند. اين DNA خارج کروموزومي، که بطور طبيعي در باکتري ها و سلول هاي يوکاريوت پست تر (مانند مخمرها) يافت مي شوند، بصورت رابطه همزيستي با سلول هاي ميزبان شان وجود دارند. پلاسميدهاي کوچکتر از آنزيم هاي همانندسازي DNA متعلق به سلول ميزبان استفاده مي کنند و پلاسميدهاي بزرگ تر حامل ژن هاي رمز کننده و آنزيم هاي خاصي هستند که براي همانندسازي آنها لازم مي باشند. تحت شرايط ويژه، بعضي از پلاسميدها ممکن است وارد کروموزوم باکتري شوند؛ که به آنها اپيزوم97 يا پلاسميدهاي تمام کننده98 مي گويند. در اين مرحله آنها همراه کروموزوم باکتري همانندسازي مي شوند (نصيري و همکاران، 1388).
همانند DNA کروموزومي سلول ميزبان، DNA پلاسميد قبل از تقسيم سلول تکثير مي شود (دو برابر مي گردد). هنگام تقسيم سلول، کپي هاي DNA پلاسميد بين هر دو سلول خواهري تقسيم مي شود تا مطمئن شود که تکثير پلاسميد در نسل هاي بعدي سلول هاي ميزبان تداوم مي يابد. پلاسميدهايي که در غالب اوقات در فن آوري DNA نوترکيب استفاده مي شوند، پلاسميدهايي هستند که در باکتري E.coli تکثير مي شوند. محققان اين پلاسميدها را طوري مورد مهندسي قرار داده اند تا استفاده از آنها بعنوان ناقل در همسانه سازي DNA مناسب گردد.
پلاسميدها داراي سه قسمت لازم براي همسانه سازي DNA هستند:
1- مبدا همانندسازي99 يا منشا تکثير (ORI)
2- يک نشانگر که امکان گزينش را فراهم مي نمايد، که معمولا يک ژن مقاومت به دارو است.
3- منطقه اي که در آن قطعات DNA خارجي مي تواند الحاق گردد (MCS)100.
آنزيم هاي سلول ميزبان، تکثير يک پلاسميد را از منشا تکثير آغاز مي نمايد، اين قسمت توالي DNA خاصي است که حدود 100-50 جفت باز طول دارد. اندازه پلاسميدها از کمتر از kb 1 تا بيش از kb 200 تغيير مي کند (جدول1-2). به طور کلي اندازه ي DNA اي که به پلاسميد مي توان افزود کمتر از kb 10 مي باشد (اسلمي نژاد و همکاران، 1385). جدول 1-2- اندازه تقريبي بعضي از پلاسميدها و منشا آنها (نصيري و همکاران، 1388)
پلاسميدها
اندازه (bp)
موجود زنده
pTZ57/RT
2886
E.coli
pBR345
700
E.coli
pBR322
4363
E.coli
Col El
6360
E.coli
F
95
E.coli
TOL
117
Pseudomonas putida
pTiAch5
213
Agrobacterium tumefaciens تعداد نسخه هاي101 يک پلاسميد از يک تا بيش از 50 برابر در هر سلول تغيير مي کند، ولي اين تعداد براي هر نوع پلاسميد خاص جايگزين شده در سلول باکتري، اختصاصي است. شکل 1-8- کروموزوم و پلاسميدها در باکتري (نصيري و همکاران، 1388) 1-3-1-11-1-1- پلاسميد pTZ
يک حامل کلون کردن مرکب102 است که محتوي مبدا همانندسازي pBR322وF1 بوده، سبب همانندسازي DNA ايپزومي به صورت تک رشته اي و دو رشته اي مي شود. براي همانندسازي تک رشته اي به فاژ کمکيM13KOV نياز است. همچنينpTZ داراي جايگاه هاي کلون کردن متعددي از pUC18 يا pUC19 هستند که کلون کردن را ساده مي کنند. ژن ? -گالاکتوزيداز سبب مي شود که کلوني هاي نوترکيب را به سادگي و با استفاده از رنگ آميزي شناسايي نمود که به اين منظور از103 X-Gal در محيط کشت استفاده مي کنند (رنگ آبي توليد مي کند). اندازه اين پلاسميد bp 2886 و جايگاه منحصر به فرد آن ژن مقاومت به آمپي سيلين در داخل ژن ?-گالاکتوزيداز مي باشد. راه اندازT7 که در داخل ژن ?-گالاکتوزيداز واقع شده، نقش الگوي ساخت در موجود زنده، و در آزمايشگاه رونوشت هاي خاص RNA از روي DNA کلون شده دارد (امين لاري، 1378). 1-3-1-12- الحاق قطعات به درون ناقل ها 104
قطعات DNA داراي انتهاي چسبنده يا انتهاي صاف مي توانند با کمک آنزيم هاي DNA ليگاز درون ناقل DNA الحاق گردند. هنگام همانندسازي DNA، DNA ليگاز اتصال دو سر قطعات کوتاه DNA، بنام قطعات اوکازاکي، را بهم کاتاليز مي کند. در همسانه سازي DNA، آنزيم DNA ليگاز براي اتصال کوو الانسي دو سر يک قطعه DNA و ناقل که داراي انتهاي مکمل هستند، بکار مي رود. DNA ناقل و قطعه DNA به صورت کووالانسي از طريق ايجاد باندهاي استاندارد 3′ ? 5′ فسفو دي استر به همديگر وصل مي شوند. علاوه بر متصل نمودن انتهاي چسبنده مکمل، DNA ليگاز استخراج شده از باکتريوفاژ T4 مي تواند دو انتهاي صاف DNA را بهم متصل نمايد. اگرچه اتصال انتهاي صاف بطور طبيعي کارايي کمتري دارد و نيازمند غلظت بالاتري از هر دو DNA و آنزيم DNA ليگاز نسبت به اتصال انتهاي چسبنده مي باشد. از اشکالاتي که ممکن است در حين کار پيش آيد اين است که هنگام اتصال قطعات DNA ممکن است به جاي اينکه قطعات DNA جديد به هم متصل شوند، دو سر يک مولکول بار ديگر به هم بچسبد و در نتيجه نوترکيبي صورت نگيرد. به همين منظور براي تبديل انتهاي چسبنده به انتهاي صاف از آنزيم Klenow در برخي واکنش هاي هضم آنزيمي استفاده مي شود (نصيري و همکاران، 1388). 1-3-1-13- فسفاتاز قليايي
فسفاتاز قليايي، فسفات5′ انتهايي باقيمانده را از اسيدهاي نوکلئيک جدا مي کند. اين آنزيم يک گليکوپروتئين دو بخشي با وزن مولکولي 14 هزار دالتون است. اين آنزيم داراي دو زير واحد يکسان يا مشابه با وزن مولکولي 69 هزاردالتون است. اين آنزيم داراي 4 اتم Zn2+ در هر مولکول است. فسفاتاز قليايي حامل هاي در حال کلون کردن را که به صورت خطي در آمده اند، دفسفوريله مي کند و از تشکيل مجدد ساختار حلقوي در آنها ممانعت به عمل مي آورد (اسلمي نژاد و سامعي، 1388). 1-3-1-14- ايجاد DNA نوترکيب
مولکول هاي DNA نوترکيب به وسيله وارد ساختن يک قطعه DNA خارجي به درون مولکول DNA يک حامل توليد مي شوند. به اين منظور انتهاي شکسته DNA به دو انتهاي توالي که بايد کلون شود، متصل مي شود. سپس اين مولکول هاي نوترکيب105، کلون مي شود (Hein et al., 2005). 1-3-1-15- دگرگوني 106
چندين گونه باکتريايي قادرند مولکول DNA را از محيطي دريافت نمايند که در آن قادر به رشد هستند، اما بيشتر اين مولکول هاي DNA بعد از ورود به باکتري تجزيه شده و از بين مي روند، چنانچه اين مولکول DNA يک پلاسميد باشد به دليل داشتن منشاء همانند سازي قابل شناسايي توسط ميزبان، بوده و قادر است در درون باکتري همانند سازي کرده و پايدار باقي بماند. انتقال ژن107 يک تکنولوژي کليدي براي دستکاري ژنوم جانوران است (اسلمي نژاد و سامعي، 1385). طي دهه هاي اخير بيوتکنولوژيست ها با وارد سازي ژنهاي متعدد و بررسي بيان آنها تحت سيستم هاي تنظيمي جديد توانسته اند بر خصوصيات ارزشمند فنوتيپي جانوران تاثيرات شگرفي بگذارند. در اين ميان ماهيان بخاطر لقاح خارجي و ظرفيت زادآوري بالا، يک سيستم ويژه و ممتاز براي مطالعات انتقال ژن محسوب مي شوند (Zakaria et al., 2005). اساساً سيستم تحويل موضعي ژن به دو روش صورت مي گيرد، روش (in vivo)، که در آن تزريق مخلوط DNA/ وکتور به درون بافت ميزبان مستقيماً انجام مي پذيرد و روش (in vitro) که ژن ها در محيط آزمايشگاه به کشت هاي سلول هاي انتقال داده شده مي شوند (Reece et al.]]>

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *