دانلود پایان نامه ارشد درباره پلاسميد، دماي، سانتي، دقيقه

دانلود پایان نامه

2001. براي ارزيابي وضعيت پلاسميد استخراجي، محصول خالص سازي (5 ميکروليتر) بر روي ژل آگارز 7/0درصد ( با قرار دادن خط کش ژنتيکي در يکي از چاهک هاي ژل) بررسي شد.

3-1-12- الحاق DNA الگو به ناقل 138
براي انجام واكنش الحاق ابتدا 3 ميکروليتر از DNA احيا شده از روي ژل را با 1 ميکروليتر از ناقل پلاسميد و 1 ميکروليتر از آنزيمDNA T4 ليگاز، 4 ميکروليتر بافر آنزيم، 1 ميکروليتر rATP، 1 ميکروليتر PEG و 9 ميکروليتر آب مقطر تزريقي مخلوط گرديد. سپس با کمک سمپلر و ضربات ملايم انگشت، به آهستگي مخلوط شد. به مدت 4 دقيقه سانتريفوژ (rpm 10000) شد. به مدت يک ساعت در حمام آب گرم و دماي 22 درجه سانتي گراد قرار گرفت (جدول3-5). سپس براي مراحل بعدي آزمايش در يخچال نگهداري شد ((Sambrook and Russell, 2001.

جدول 3-5- ترکيب و حجم مواد در واکنش الحاق
حجم واكنش (µl20)
اجزاء واكنش
µl3
DNA(Insert-Digest BamHI&Dephosphorylation&Gel Recovery)
µl 1
Vector pTZ57R/T (Digest BamHI&Dephosphorylation)
µl 1
T4 DNA Ligase
µl 4
Enzyme Buffer(5x)
µl 1
rATP
µl 1
PEG
µl 9
DDW(تزريقي)

3-1-13- انتقال پلاسميد نوترکيب به سلول پذيرا
در ابتدا سلول هاي پذيراي از قبل آماده شده (ميکروتيوب هاي 5/1 يا 2 ميلي ليتري) را 30 دقيقه قبل از شروع اين مرحله از فريزر 70- درجه سانتي گراد خارج نموده، و بر روي يخ نگهداري شد. به ميزان µl10 از محصول مرحله قبل (الحاق پلاسميد به قطعات برش يافته) با سلول هاي پذيرا (به آهستگي و با کمک سمپلر) مخلوط شد. لوله ها بر روي يخ به مدت 30 دقيقه قرار داده شد. سپس آنها بلافاصله به مدت 3 دقيقه در معرض دماي 42 درجه سانتي گراد (ترجيحاً حمام آب گرم و يا گرماي خشک مانند انکوباتور يا هات پليت) قرارگرفتند.
بلافاصله به مدت 5 دقيقه بر روي يخ (يا درون يخچال) انتقال يافتند. به هر ميکروتيوب 700 ميکروليتر از محيط کشت LB(به دماي 37 درجه سانتي گراد رسيده و بدون آنتي بيوتيک) اضافه شد. به مدت يک ساعت درون انکوباتور شيکردار (rpm 200) و در دماي 37 درجه سانتي گراد قرار گرفتند. سپس به مدت 3 دقيقه و در دماي 4 درجه سانتي گراد، سانتريفوژ (rpm 3000) شدند. بيشترمايع رويي را دور ريخته و با استفاده از حدود µl100 از محلول رويي باقي مانده، رسوب حاصل را به آهستگي حل کرده تا يک سوسپانسيون همگن تشکيل شود. سوسپانسيون بر روي پليت حاوي نشانگرهاي انتخابي139، با کمک spreader (يا پيپت پاستورهاي خم شده) به خوبي پخش شد. پليت ها به مدت يک شبانه روز (16-12 ساعت) جهت رشد باکتري ها در انکوباتور بطور وارونه نگهداري شدند ((Sambrook and Russell, 2001. ضمناً به منظور کنترل انتقال DNA به درون سلول پذيرا، دو واکنش زير به طور همزمان با مراحل فوق انجام پذيرفت:
الف- اجراي مراحل ترانسفورماسيون بدون افزودن DNA پلاسميد (کنترل منفي)
ب- اجراي مراحل ترانسفورماسيون بوسيله ناقل هضم نشده (کنترل مثبت)

13-1-14- بررسي سريع پلاسميد هاي نوترکيب
بعد از اينکه پليت باکتري دگرگون شده به مدت يک شبانه روز (حدود 16 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتي گراد) رشد کرد، به طور تصادفي يک تک کلون آبي (با کمک سر سمپلر) انتخاب و به ميکروتيوب حاوي µl 50 از EDTA (10 ميلي مولار با (pH=8 منتقل شد. با دستگاه ورتکس خوب مخلوط نموده تا مخلوط همگني بدست آيد. µl50 بافر تازه غربال گري سريع (Cracking Buffer) به ميکروتيوب اضافه شد. با کمک ورتکس به خوبي مخلوط گرديد. 5 دقيقه در دماي اتاق نگهداري شد. µl 5/1 از محلول کلريد پتاسيم (KCL) 4 مولار و µl 5/0 برومو فنل بلو (4/0 درصد) به آن اضافه و به خوبي ورتکس شد. 5 دقيقه بر روي يخ نگهداري شد. به مدت 3 دقيقه و دماي 4 درجه سانتي گراد سانتريفوژ (rpm 12000) شد. µl30 از محلول فوق براي بررسي عملکرد ترانسفورماسيون جهت بررسي وضعيت پلاسميد و قطعه الحاقي بهمراه µl 5 از يک خط کش ژنتيکي (Marker) بر روي ژل آگارز 7/0 درصد بارگيري شد تا الگوي حرکتي ناقل و پلاسميد نوترکيب بدست آيد ((Sambrook and Russell, 2001.

3-1-15- تخليص پلاسميد به روش ليز قليايي140
استخراج پلاسميدهاي نوترکيب از باکتري به روش شکستن قليايي141 و به شرح ذيل انجام گرفت:
يک کلني آبي از باکتري حاوي پلاسميد و قطعه DNA الحاقي و 5/2 ميلي ليتر محيط کشت مايع LB بهمراه µl 5/2 آنتي بيوتيک آمپي سيلين را درون يک لوله آزمايشگاهي استريل با حجم 15 ميلي ليتر قرار داده و به مدت يک شبانه روز در انکوباتور شيکردار (rpm 180) با دماي 37 درجه سانتي گراد قرار گرفت. بعد از يک شبانه روز، لوله مذکور به مدت 10 دقيقه سانتريفوژ (rpm3500) شد. به رسوب خشک شده به ميزان µl 200 از محلول ليزکننده قليايي شماره يک (EDTA 10 ميلي مولار و Glucose 50 ميلي مولار و Tris-Hcl 25 ميلي مولار با pH=8 و دماي 4 درجه سانتي گراد) اضافه شد. چند بار به آهستگي سر و ته شده و به مدت 10 دقيقه در دماي اتاق نگهداري شد. سپس µl 400 از محلول تازه ليزکننده قليايي شماره دو (آب مقطر مورد نظر را در بشر ريخته و سپس هيدروکسيد سديم 2/0 نرمال وSDA يک درصد به آن اضافه شود. عدم رعايت ترتيب فوق سبب بروز رسوب در محلول تهيه شده مي شود ضمناً محلول فوق بايد تازه تهيه و مصرف شود) اضافه شد. چندبار آهسته سر و ته و به مدت 5 دقيقه در دماي 4 درجه سانتي گراد (روي يخ يا درون يخچال) سرد شد. سپس µl 300 از محلول ليزکننده قليايي شماره سه (60 ميلي ليتر از استات پتاسيم 5 مولار را با 5/11 ميلي ليتر اسيداستيک مخلوط کرده و سپس حجم محلول با آب مقطر تزريقي به 100 ميلي ليتر رسانده شود) اضافه و چندبار سر و ته و به مدت 30
دقيقه در دماي 4 درجه سانتي گراد قرار داده شد. به مدت 15 دقيقه در دماي 4 درجه سانتي گراد سانتريفوژ (rpm 12500) شد. مايه رويي به يک لوله جديد منتقل و هم حجم آن ايزوپروپانل سرد اضافه شد. چندبار آهسته سر و ته و به مدت 45 دقيقه در دماي 4 درجه سانتي گراد سرد شد. به مدت15 دقيقه در دماي 4 درجه سانتي گراد سانتريفوژ (rpm 12500) شد. به رسوب حاصل به ميزان µl 500 الکل اتانول 70 درصد اضافه شد. چندبار آهسته سر و ته و به مدت 5 دقيقه در دماي 4 درجه سانتي گراد سانتريفوژ (rpm 8000) شد. رسوب حاصل بطور کامل خشک شده و به آن µl 40 آب مقطر تزريقي اضافه شد. به مدت يک شبانه روز در دماي 4 درجه سانتي گراد قرار داده شد. به ميزان µl 5 از محلول فوق (بعد از گذشت يک شبانه روز) جهت بررسي وضعيت پلاسميد و قطعات جدا شده، بهمراه µl 5 از يک خط کش ژنتيکي (Marker) بر روي ژل آگارز 7/0 درصد بارگيري شد. تا الگوي حرکتي پلاسميد و پلاسميد نوترکيب بدست آيد ((Sambrook and Russell, 2001. از بين آنها پلاسميد هاي نوترکيبي که الگوي حرکتي بالاتري نسبت به ناقل ( بدون قطعه مورد نظر) دارند، جهت تعيين توالي مستقيم142 انتخاب شد.

3-1-16- تعيين توالي نوکلئوتيدي
جهت جداسازي و شناسايي توالي قطعات کلون شده، پلاسميد هاي نوترکيب مثبت به منظور تعيين توالي نوکلئوتيدي، توسط شرکت زيست فناوري کوثر به آزمايشگاه Seqlab کشور آلمان ارسال شد.

3-1-17- طراحي و مشخصات آغازگرها
پس از دريافت توالي قطعات مورد نظر با بكارگيري نرم افزارهاي طراحي آغازگر فاست‌پي‌سي‌آر143، اليگو144، اديت سک145 تعداد شش جفت آغازگر جهت ساخت به شرکت روبين طب گستر، سفارش داده شد. پس از دريافت آغازگرها طبق دستور شرکت سازنده به صورت محلول درآورده شدند و به نسبت 1 به 10 رقيق و در ميکروتيوب هاي 5/0 ميلي ليتري به ميزان µl 30 توزيع و در دماي 20- درجه سانتي گراد نگهداري شدند.

3-1-18- واكنش زنجيره‌اي پليمراز (PCR)
برنامهPCR شامل32 سيكل تكثير با دماي واسرشت شدن اوليه 94 درجه سانتي گراد به مدت 1 دقيقه، سپس دماي واسرشت 94 درجه براي 30 ثانيه، دماي اتصال متغير براي مدت 30 ثانيه، دماي تكثير 72 درجه به مدت 30 ثانيه و دماي تكثير نهايي 72 درجه سانتي گراد به مدت 30 ثانيه بود كه بوسيله دستگاه ترموسايكلر بهينه شد. ضمناً حجم نهايي واکنش 25 ميکرو ليتر بوده كه مواد آن با غلظت نهايي در جدول 3-6 مشخص مي‌باشد.

جدول 3-6- ترکيب و ميزان مواد در واکنش PCR
حجم واکنش(µl 25)
اجزاي واکنش
1
DNA Template
1
dNTP
5/2
PCR Buffer
25/1
MgCl2
3/0
Taq polymerase
2
Forward primer
2
Reverse primer
25/14
تزريقي DDW

3-1-19- بررسي محصولات PCR برروي ژل آگارز
نتيجه تكثير يا عدم آن به كمك الكتروفورز روي ژل آگارز 5/1 درصد با ولتاژ 80 ولت، 75 ميلي آمپر و 8 وات به مدت 55-45 دقيقه ارزيابي گرديد. همچنين براي تعيين اندازه قطعه تكثير يافته (طول باند) از خط کش ژنتيکي146 100 جفت بازي، محصول شركت فرمنتاز147 استفاده شد.

3-1-20- ثبت تصاوير
تصوير ژل هاي تهيه شده توسط دستگاه مستند سازي ژل (Gel documentation) همراه با برنامه نرم‌افزاري Quantity One – version 4.6.5 تهيه شد. براي به دست آوردن اندازه آلل ها و تعيين انواع آنها و نيز تعيين ژنوتيپ ها، از تصاوير عکس برداري شده ژل ها استفاده شد. از نرم افزارهايBio Edit ، EditSeq و Oligo جهت طراحي آغازگرها استفاده شد. وزن باندهاي موجود بر حسب bp به کمک مارکر 5 و نرم افزارLabImage 1D 2006 بدست آمد.

فصل چهارم

نتايج

4-1- نتايج بررسي كميت و كيفيت DNA استخراج شده
كميت وكيفيت DNA به دو روش مورد ارزيابي قرار گرفت كه نتايج آن به شرح ذيل مي باشد:

4-1-1- روش الكتروفورزي
بررسي شدت وضوح باندهاي DNA بر روي ژل آگارز (7/0 درصد) نشان داد كه DNA هاي استخراج شده از باله دمي ماهي راشگوي معمولي با کمک روش بهينه شده CTAB از كيفيت قابل قبولي براي استفاده در آزمايش هاي کلون سازي و PCR برخوردار مي باشند (شکل4-1). وجود اسمير در انتهاي بعضي از نمونه ها نشانگر شکسته شدن DNA و وجود RNA مي باشد.

شکل4-1- نمونه‌اي ازDNA استخراج شده به روش CTAB(چاهک هاي 1 تا 10) روي ژل آگارز 7/0 درصد

4-1-2- طيف سنجي DNA
ميزان جذب در طول موج nm 260 ونسبت طول موج nm260 به 280 بوسيله اسپكتروفتومتر قرائت گرديد. نمونه هائي كه اين نسبت براي آنها 8/1 تا 2 بود انتخاب و در مورد نمونه هاي نامناسب استخراج DNA براي آنها تكرار گرديد. غلظت DNA استخراجي بر اساس فرمول محاسبه شده در كلـيه 30 نمونه بين ng/ml 240-155 بود كه پس از رقيق سازي و همسان سازي غلظت DNA، در غلظت ng/ml 100 مورد استفاده قرار گرفت.
بيش از 30 روش متداول استخراج DNA براي اين ماهي در يک فاصله زماني چهار ماهه آزمايش شد که در نهايت روش بهينه شده ي CTAB بعنوان تنها روش قابل قبول در اين تحقيق استفاده گرديد.

4-2- نتايج حاصل از برش آنزيمي پلاسميد
براي هضم آنزيمي پلاسميد از آنزيم BamHI استفاده شد. الگوي هضم آنزيمي پلاسميد با روش الكتروفورز ژل آگارز 7/0 درصد و رنگ آميزي اتيديوم برومايد مشخص گرديد (شکل4-2).

M 1

شکل4-2- پلاسميد هضم شده (چا
هک 1) با آنزيم BamHI روي ژل آگارز 7/0 درصد (M، مارکر)

4-3- نتايج حاصل از برش آنزيمي DNA ژنومي
براي هضم آنزيمي DNA ژنومي از آنزيم BamHI استفاده شد. الگوي هضم آنزيمي DNA ژنومي با روش الكتروفورز ژل آگارز 7/0 درصد و رنگ آميزي اتيديوم برومايد مشخص گرديد (شکل 4-3).

1 M

شکل4-3- DNA ژنومي هضم شده(چاهک 1) با آنزيم BamHI روي ژل آگارز7/0 درصد (M ، مارکر)

4-4- نتايج حاصل از خالص سازي پلاسميد
خالص سازي پلاسميد با کمک کيتHigh Pure plasmid isolation انجام گرفت. پلاسميد تخليص شده، با روش الكتروفورز ژل آگارز 7/0 درصد و رنگ آميزي اتيديوم برومايد مشخص گرديد (شکل 4-4).

2 M 1

شکل4-4- پلاسميد خالص سازي شده (چاهک 2) با کيت روي ژل آگارز7/0 درصد (چاهک 1 پلاسميد قبل از برش آنزيمي و خالص سازي، M مارکر)

4-5- احياي قطعات کوچک از روي ژل آگارز
پس از مشخص شدن الگوي هضمي DNA، با کمک تيغ آزمايشگاهي تميز قطعات در محدوده 300 تا 700 جفت باز (bp) از روي ژل آگارز بريده و بطور جداگانه در ميکروتيوپ هاي استريل نگهداري شد (شکل 4-5).

1 2 M 3 4

شکل4-5- قطعاتDNA ژنومي برش يافته با آنزيم (چاهک هاي 1 تا 4) از روي ژل آگارز 7/0 درصد (M، 100 bp DNA Ladder)

4-6- نتايج حاصل از فسفاتاز قليايي پلاسميد
به منظور جلوگيري از ايجاد ساختار حلقوي پلاسميد، محصول هضم آنزيمي با کمک آنزيم فسفاتاز قليايي (SAP)، دفسفريله شد.

4-7- نتايج حاصل از فسفاتاز قليايي قطعات برش يافتهDNA ژنومي
با هدف جلوگيري از ايجاد ساختار حلقوي DNA ژنومي، محصول هضم آنزيمي با کمک آنزيم فسفاتاز قليايي (SAP)، دفسفريله شد (شکل 4-6).

دیدگاهتان را بنویسید