پایان نامه ارشد با موضوع استرس اکسیداتیو، اکسیداسیون

شکل 2-12. نمایی از مکانیسم اثر LPS بر تحریک تولید COX-2. LPS توسط TLR4 موجود در سطح ماکروفاژ‌ها، نوتروفیل‌ها و مونوسیت‌ها شناسایی می‌شود. این سلول‌ها در پاسخ به این محرک شروع به ترشح IL-1 و IL-6 می‌کنند. این سایتوکاین‌ها در سطح غشا رسپتور دارند بنابراین به رسپتور مخصوص خود اتصال می‌یابند. این عمل منجر به تحریک عملکرد COX-2 و در نتیجه تولید PGE2 می‌شود. سالمونلا انتریکا یک باکتری داخل سلولی اختیاری است که قادر به زنده ماندن در داخل ماکروفاژ‌ها می‌باشد. یکی از فاکتور‌های ویرولانس اختصاصی که توسط سالمونلا کد می‌شود جزیره بیماریزایی-2 (SPI-2)37 است که برای رشد باکتری داخل ماکروفاژ و ایجاد ویرولانس در موش‌ها ضروری است. این فاکتور در تحریک بیان COX-2 نقش دارد به این صورت که سالمونلا با فعال کردن مسیر تنظیمی‌سیگنال خارج سلولی (ERK1/2) وابسته به SPI-2 منجر به بیان COX-2 و افزایش پروستاگلاندین E2 و I2 در ماکروفاژ‌ها می‌شود. COX-2 با فعال کردن مسیر سیگنال‌دهی پروتئین کیناز A می‌تواند در زنده ماندن سالمونلا داخل ماکروفاژ‌ها مؤثر باشد، بنابراین به نظر می‌رسد که سالمونلا با بکارگیری مسیر COX-2 می‌تواند در داخل ماکروفاژ‌ها زنده بماند (73).
2-6. هیدروژن پراکسید
2-6-1. تاریخچه هیدروژن پراکسید
در سال 1818 میلادی، هیدروژن پراکسید برای اولین بار توسط لوئیس جکیوس تنارد38 شناخته شد. او با واکنش دادن باریم پراکسید با اسید نیتریک، هیدروژن پراکسید را تولید کرد. نوع بهتر این فرآیند برای رسوب سریع محصول باریم سولفات، با استفاده از اسید هیدروفیلیک سولفوریک اسید امکان‌پذیر بود. روش تنارد از قرن 19 تا اواسط قرن 20 مورد استفاده قرار گرفت. هیدروژن پراکسید با درجه خلوص 100% توسط ریچارد ولفنشتاین39 در سال 1894 بدست آمد. در اواخر قرن 19، پتر ملیکیشویلی40 نشان داد که صحیح‌ترین فرمول هیدروژن پراکسید، H−O−O−H است (47). هیدروژن پراکسید (H2O2) یک محصول متابولیک اکسیژن واکنشگر است که به عنوان تنظیم کننده در برخی از حالات استرس اکسیداتیو به شمار می‌رود. به دلیل عملکرد آن در کنار NF-kB و دیگر فاکتور‌ها، مسیر‌های با واسطه‌ی هیدروژن پراکسید، با بیماری‌هایی مثل آسم، آرتریت التهابی، آرتریو اسکلروزیس، استئوپوروسیس و سندروم داون مرتبط است. جنبه‌ی جالب بیولوژی هیدروژن پراکسید، گزارش اخیری است که در مورد توانایی آنتی‌بادی‌ها در تبدیل اکسیژن مولکولی به هیدروژن پراکسید به منظور شناسایی و دخالت در مسیر‌های تخریبی سیستم ایمنی می‌باشد. اندازه‌گیری این گونه‌های واکنشگر به تعیین چگونگی تنظیم مسیر‌های داخل سلولی توسط استرس اکسیداتیو کمک می‌کند (109و42و23).
گونه‌های واکنشگر اکسیژن (ROS)41 شامل آنیون‌های اکسیژن و رادیکال‌ها (•O2- و OH·) یا اکسیدانت‌های ضعیفی مثل هیدروژن پراکسید هستند. داده‌هایی زیادی مبنی بر آسیب سلولی حاصل از ROS در دست است. تولید ROS با استرس اکسیداتیو، آپوپتوز، پیری و مرگ مرتبط می‌باشد. در سال‌های اخیر، سابقه‌ی بدی که از ROS و هیدروژن پراکسید وجود داشت تغییر یافته است. امروزه این مولکول‌ها با نام مولکول‌های زندگی شناخته می‌شوند که برای توسعه و تکثیر سلول‌ها ضروری هستند. گفته می‌شود که هیدروژن پراکسید در دوز‌های پایین می‌تواند اثرات میتوژنیک از خود نشان بدهد و از عملکرد فاکتور‌های رشد تقلید کند. سلول‌ها با تولید هیدروژن پراکسید از آن به عنوان پیامبر ثانویه برای انتقال و تقویت سیگنال استفاده می‌کنند. H2O2 مولکول ریزی است که به داخل سلول می‌تواند نفوذ کند. در مقایسه با دیگر گونه‌های واکنشگر اکسیژن مثل آنیون‌های سوپر اکسید (با نیمه عمر μs 1)، هیدروژن پراکسید (با نیمه عمر ms 1) پایدارتر است. پایداری هیدروژن پراکسید تحت‌تأثیر تغییر pH و تعادل ردوکس داخل سلولی می‌باشد. بر خلاف دیگر گونه‌های واکنشگر اکسیژن مهاجم مثل رادیکال‌های هیدروکسیل که با برخورد به هر مولکولی با آن واکنش می‌دهند، هیدروژن پراکسید که اکسیدانتی ضعیف‌تر می‌باشد فقط رزیدو‌های سیستئینی برخی پروتئین‌ها را مورد هدف قرار می‌دهد (81و27و5).
2-6-2. بیولوژی هیدروژن پراکسید
هیدروژن پراکسید نقش مهمی‌در سیستم ایمنی دارد. بر اساس یافته‌های دانشمندان هیدروژن پراکسید داخل سلولی پس از آسیب بافت افزایش می‌یابد که به عنوان سیگنالی برای گلبول‌های سفید خون است تا فرآیند ترمیم آغاز گردد. در صورتی که در ژن تولید کننده‌ی هیدروژن پراکسید نقصی وجود داشته باشد، سلول‌های خونی هم در محل آسیب تجمع نمی‌یابند. این تحقیق روی ماهی انجام گرفته بود و با توجه به اینکه ماهی از لحاظ ژنتیکی به انسان نزدیک است، فرآیند یکسانی برای انسان هم می‌تواند توضیح داده شود. بیمارانی که از آسم رنج می‌برند میزان زیادی از هیدروژن پراکسید را در ریه خود دارند که توضیحی برای میزان غیر طبیعی گلبول‌های سفید خون در ریه این افراد می‌باشد. بنابراین هیدروژن پراکسید نقش مهمی‌ به عنوان مولکول سیگنالینگ در تنظیم برخی از فرایند‌های بیولوژیک محسوب می‌شود. هیدروژن پراکسید در سرطان و پیری هم اثر دارد. مقادیر هیدروژن پراکسید در سیستم‌های بیولوژیکی با استفاده از سنجش فلوریمتریک اندازه‌گیری می‌شوند (96و70و37
). 2-6-3. گونه‌های واکنشگر اکسیژن
یکی از سیستمهای فعال در سلول که در بسیاری از فرآیندهای سلولی دخیل میباشد، سیستم اکسیداسیون- احیا (Redox) است؛ که مجموعهای از اکسیدانها و آنتی‌اکسیدانها میباشد. از جمله مهمترین عوامل اکسید کننده داخل سلولی گونههای واکنش‌پذیر اکسیژن (ROS)42 هستند، که در طی متابولیسم هوازی به صورت ثابت در ارگانیسمها تولید میشود و نسبت به اکسیژن، اکسید کننده‌های مؤثرتری هستند و واکنش‌پذیری بالاتری دارند. در داخل سلول عوامل احیا کننده و آنتی‌اکسیدان هم وجود دارند که مسمومیت‌زدایی از این گونههای اکسیژن واکنش‌پذیر را به عهده دارند. هنگامیکه تعادل آنها به هم میریزد وضعیت به صورت فشار اکسایشی یا استرس‌های اکسیداتیو تعریف میشود. اگر فشار اکسایشی پایدار باشد صدمات حاصله بر مولکول‌های زیستی بر روی هم انباشته میشود و سرانجام اثرات بیولوژیک متعدد را از تغییرات در انتقال سیگنال و تجلی ژن گرفته تا میتوززایی، تکثیر، جهشزایی، تمایز، مرگ و سرطان را سبب میشود (49و12). به عبارت دیگر سیستم ردوکس با تأثیر روی هورمونها سایتوکاینها و فاکتورهای رشد و تأثیر روی انتقال سیگنال وقایعی را که سلول با آن روبهرو است را سبب می‌شود. امروزه توجه خاصی به ردهای از سلولها به نام سلولهای بنیادی معطوف شده است؛ زیرا این سلولها این قابلیت را دارند که به انواع مختلف سلولها در طول زندگی و رشد متمایز شوند. و از آنها میتوان در تولید سلولها و نهایتاً بافتهای مختلف استفاده کرد. در این مطالعه برآنیم که تأثیر سیستم ردوکس را روی تکثیر و تمایز سلولی بررسی کنیم.
2-6-4. ROS و منابع تولید آن
اعضای خانواده ) ROSشامل رادیکالهای هیدروکسیل، آنیون سوپراکسید و اکسیژن منفرد و پراکسید هیدروژن) از مسیر‌های مختلفی در سلول تولید میشوند (شکل 1). در سلولهای هوازی مهمترین منابع 2-O زنجیره انتقال الکترون میتوکندری و NADPH سیتوکروم P450 در شبکه آندوپلاسمی‌میباشد. منابع دیگر تولیدکننده ROS عبارتند از هیپوگزانتین، گزانتین اکسیداز، NADPH اکسیداز، لیپواکسیژناز، سیکلواکسیژناز دی اکسیژنازها، اکسیداز‌ها، سلولهای فاگوسیت مانند نوتروفیل و ماکروفاژ و … است (55).
ثابت شده که غلظت پایین در حدود 6-10 تا 8-10مولار H2O2 میتواند رشد سلول‌های فیبروبلاست را تحریک کند. غلظتهای بیشتر ROS میتواند کاهش تعداد سلولها را سبب شود. افزایش میزان ROS در سلول‌های یوکاریوت سبب توقف رشد، القای پیری، آپاپتوزیس و نکروزیس میشود. رشد سلولهای فیبروبلاست در غلظت 3 تا 15 میکرو مولار H2O2اتفاق میافتد و توقف رشد در غلظت‌های 120 تا 150 میکرو مولار آن دیده میشود. غلظت 5/0 تا 1 میلی‌مولار H2O2 سبب آپاپتوز و غلظت بیش از 5 میلی مولار آن سبب نکروز میشود (24).
شکل 2-13. منابع تولید کننده ROS 2-6-5. سیستم اکسیداسیون- احیا و تکثیر سلولی
رسپتورهای تیروزینکیناز با فاکتورهای رشد فعال میشود و آبشار حاصل از فسفریلاسیون تیروزین را به راه میاندازند. سپس زیر واحد کاتالیک PI3K و P58 فعال میشود که در نهایت منجر به تغییر شکل Rac-1 به فرم فعال GTP میشود. NADPH اکسیداز شامل NOX1 و NOX4، H2O2 لازم را در پاسخ به فاکتورهای رشد ایجاد میکند فرم فعال GTP میتواند به طور مستقیم با NOX143 در غشا باند شود.NOX1 به عنوان واسطهای برای تولید یون سوپراکسید عمل میکند و قسمتی از آن تبدیل به H2O2 میشود و در نهایت MAPk کینازها فعال میشود که منجر به جفت و جور شدن فاکتور رونویسي AP-1 میگردد و تکثیر سلولی را فراهم میآورد (12). P38 MAPK به طور مستقیم مسئول القاء تکثیر سلولی است. فعال شدن فاکتور رونویسی Jun c-و ATF-2 این فرضیه را تقویت میکند (43). ثابت شده كه H2O2آزاد شدن اسيد آراشيدونيك و توليد 44PGE2 را از طريق فعاليت MAPKs /PKC /45EGFR /+2 Ca افزايش مي‌دهد كه در نهايت منجر به تكثير سلولي در سلول‌هاي بنیادی جنینی (ES) 46موش مي‌شود (58). شکل 2-14. سیستم اکسیداسیون- احیا و تکثیر سلولی. H2O2 ميزان +2 Ca داخل سلولي و فعاليت PKC را افزايش مي‌دهد كه اين منجر به فعال شدن مسير‌هاي MAPKs شامل P44/42 وp38 و JNK/47SAPK مي‌شود سپس 48cPLA2 فعال مي‌شود و آزاد شدن اسيد آراشيدونيك را تحريك مي‌كند. MAPKs همچنين EGFR را فعال مي‌كند كه فسفريلاسيون cPLA2 آزاد شدن اسيد آراشيدونيك را موجب ميشود. از سوي ديگر +2 Ca/ PKC فعاليت NF-κB را القا و آن هم فعاليت 2-49Cox را تحريك مي‌كند كه آن هم موجب توليد PGE2 مي‌شود و تكثير سلولي ES 50را تحت‌تأثير قرار مي‌دهد (58). 2-6-7. ردوکس و تمایز سلولهای بنیادی
بيان انواع NADPH اكسيدازها توسط سلولهاي بنيادين
مطالعات اخير نشان از نقش آنزيمهاي NOX در فرايند تمايز سلولهاي بنيادين جنيني موش دارند. به عنوان مثال بيان انواع مختلف NOX در ردههاي سلولي DBA/25251 و D352 از سلولهاي بنيادين جنيني موش نشان داده شده است و مشخص شده كه آنزيمهاي خانواده NOX شامل NOX1، NOX2، NOX4 و DUOX153 در اين ردههاي سلولي موجود بوده و به صورت مشابهي رده سلولي بنيادين جنيني DBA/252 p38 نيز اين آنزيمها را بيان ميكنند.
نقش ROS توليد شده توسط آنزيمهاي NOX در روند تمايز سلولهاي بنيادين خوني انسان بررسي شده است. در اين سلولها NOX2 و NOX4 به همراه زير واحدهاي تنظيمي p67phox54، p47phox55 و p40phox56 مشاهده شده است. كشت HSCها تحت شرايط‌هايپوكسي يا در حضور آنتياكسيدانها از تمايز اين سلولها جلوگيري كرده و به حفظ خاصيت چندتواني آنها كمك مي‌نمايد. NOX‌ها نقش حسگر O2 و منبع ROS را دارند كه به عنوان پيامبرهاي redox در فعاليت مسيرهاي سيگنالدهنده درون سلولي كه منجر به توليد م
يتوكندري، بقاي سلول و تمايز سلول‌هاي بنيادين خوني ميشود، به كار برده ميشوند (13).
شکل 2-15. نقش ROS در چرخه‌ی سلولی غلظت ROS لازم براي تمايز سلولهاي بنيادين توليد شده توسط NOX‌ها ميتواند در آبشارهاي سيگنالدهنده به كار برده شود كه اين امر منجر به رونويسي ژنهاي هدايت كننده تمايز به سوي ردههاي سلولي بافتهاي خاص و متعدد ميگردد. سلولهاي تمايز نيافته بيشتر پراكسيده مي‌شوند و يا ميتوان گفت محيط درونسلولي احيا شده كمتري در مقايسه با سلولهاي تمايز نيافته دارند (44).
2-6-8. ردوکس و تمايز سلول بنيادين جنيني به سلولهاي ماهيچه صاف (SMC)
ثابت شده است كه H2O2 مشتق از NOX4 براي تمايز SMC57 از سلولهاي بنيادين جنيني حياتي است. ديده شده كه در طي تمايز سلول بنيادين جنيني βTGF- اتوكرين، NOX4 را فعال ميكند. در نتيجه H2O2]]>