پایان نامه ارشد با موضوع نفوذپذیری، مورفولوژی

در سال 2000، Bobby J.Cherayil و همکارانش آنالیز القای بیان iNOS در ماکروفاژ‌ها توسط سالمونلا انجام دادند و به این نتیجه رسیدند که تیپ وحشی سالمونلا می‌تواند هم میزان پروتئین iNOS و هم میزان mRNA مربوطه را در سلول‌های ماکروفاژ موش افزایش دهد. میانجی نهایی القای iNOS، پروتئین افکتوری است که از طریق سیستم ترشحی تیپ III و در مسیری وابسته به SipB، SipC و SipD به داخل ماکروفاژ‌ها منتقل می‌شود.
در سال 2000، Emiko Fujii و همکارانش طی مطالعاتی که در مورد تزریق زیر جلدی و یا درون پوستی LPS در پوست موش و رت انجام دادند به این نتیجه رسیدند که افزایش نفوذپذیری رگها توسط LPS در موش‌های وحشی بطور عمده وابسته به تولید NO به وسیله‌ی iNOS می‌باشد ولی در موش‌های فاقد iNOS، LPS با مکانیسمی‌مستقل از iNOS میزان نفوذپذیری رگها را تغییر می‌دهد که این کار را به واسطه‌ی میانجی‌هایی مثل ایکوزانوئید‌ها، هیستامین و TNF-αانجام می‌دهد.
در سال 2001، Kaoru Irie و همکارانش طی مطالعه‌ای که روی اثر ضد التهابی عوامل افزایش دهنده‌ی CAMP در مدل موشی که نفوذپذیری درون رگی آن با لیپوپلی ساکارید تغییر یافته بود انجام دادند به این نتیجه رسیدند که عوامل افزایش دهنده‌ی CAMP با جلوگیری از بیان TNF-α به واسطه‌ی LPS، در کاهش میزان نفوذپذیری رگها اثر می‌گذارند. با تزریق زیر جلدی LPS به موش، پس از یک ساعت میزان TNF-α بالا می‌رود که در این زمان CAMP می‌تواند تولید آن را مهار کند و در کاهش نفوذپذیری رگ‌ها اثر بگذارد. ولی در مقابل، IL-1 که به واسطه‌ی LPS افزایش یافته است، تحت‌تاثیر هیچکدام از عوامل CAMP قرار نمی‌گیرد.
در سال 2011، حسین رستگار، حمیدرضا احمدی آشتیانی و همکاران با بررسی اثر LPS سالمونلا انتریتیدیس بر سلول‌های سرطانی کبدی، به این نتیجه رسیدند که افزودن LPS به محیطی که COX-2 دارد نه تنها LPS باعث بیان COX-2 نمی‌شود بلکه به مهارکننده‌ی COX-2 کمک می‌کند تا فعالیت COX-2 را کاهش دهد. از مهارکننده‌های COX-2 می‌توان در درمان سرطان استفاده کرد و با توجه به اینکه LPS در این مجموعه کمک‌رسانی می‌کند در آینده می‌توان در طراحی دارو‌های ضد سرطانی از آن استفاده کرد.
2-1-1. تاریخچه‌ لیپو پلی ساکارید
تب یکی از ابتدایی‌ترین یافته‌های علم پزشکی گزارش شده است. در سال‌های گذشته فرض محققین بر این بوده که تحریک کننده‌های تب وجود فیزیکی داشته و پیروژن نامیده می‌شدند که بر آمده از ریشه یونانی pyr به معنی آتش بود. با پیشرفت علوم گفته شد که تب تظاهری از بیماری یا دفاع میزبان علیه بیماری است. آلبرشت ون‌هالر1 پیشوایی در زمینه‌ی لیپو پلی ساکارید (اندوتوکسین) بود که نشان داد بعد از تزریق داخل وریدی اندوکسین، بافت تجزیه شده توانایی تحریک تب در حیوانات را دارد. در سال 1982 میلادی ریچارد فیفر2 گزارش کرد که ویبریو کلرا دارای توکسینی است که بخشی جدایی‌ناپذیر از بدنه‌ی باکتری است.
اندوتوکسین برای اولین بار در سال 1932 میلادی توسط آندره بوئیوین3 و لیدیا مسروبنو4 و بر اساس روش تری کلرو استیک اسید (TCA) خالص‌سازی شد. والتر مورگان5 و والتر گوبل6 با استفاده از حلال‌های ارگانیک و آب موفق به تخلیص اندوتوکسین شدند. یافته‌های هر دو گروه نشان می‌داد که اندوتوکسین ترکیبی از لیپید و پلی ساکارید و همچنین میزان کمی‌از پروتئین‌های مرتبط بود. با اینکه این ترکیب خام دستاوردی عظیم در درک ما از LPS بود، تصور روش‌های جایگزین دیگر برای تخلیص منجر به خالص‌سازی محصول با درجه‌ی بالا و درک بهتر مولکول می‌شد. اتو وستفال7 و اتو لودریتز8 دانشمندانی بودند که موفق به تخلیص با درجه‌ی بالاتر و اندوتوکسینی با فعالیت بیولوژیکی از باکتری‌های گرم منفی مختلف با روش استخراج آب- فنول داغ9 شدند. محصول آنها فاقد پروتئین و فقط حاوی کربوهیدرات، اسید‌های چرب و فسفر بود. آنها اولین کسانی بودند که کلمه‌ی لیپو پلی ساکارید را برای توضیح اندوتوکسین به کار بردند، اگرچه این کلمه در زمان جامعه‌ی دانشمندی آنها مورد قبول قرار نگرفته بود. همچنین مطالعات دیگری در رابطه با اثبات حضور LPS در باکتری‌های گرم منفی بیماریزا و غیر بیماریزا توسط وستفال و لودریتز صورت گرفت. در حال حاضر می‌دانیم که LPS در لایه‌ی بیرونی غشای خارجی باکتری‌های گرم منفی قرار گرفته است و موتانت‌هایی که دارای نقص در مراحل اولیه‌ی بیوسنتز LPS هستند زنده نمی‌مانند.
لیپو پلی ساکارید باکتریایی از اجزای اصلی لایه‌ی بیرونی غشای خارجی باکتری‌های گرم منفی است که در علم پزشکی اغلب به دلیل دارا بودن ویژگی‌های تنظیمی ‌ایمنی مورد استقبال قرار می‌گیرد. بطوریکه در مقادیر کم می‌توانند مفید واقع شوند ولی در مقادیر زیاد ممکن است باعث شوک اندوتوکسیک شوند. لیپو پلی ساکارید (LPS)10 از اجزای اصلی آمفی فیلیک در غشای بیرونی باکتری‌های گرم منفی است اما در طول تقسیم سلولی و انواع پروسه‌های بیوشیمیایی و همچنین با در دست گرفتن سیستم ایمنی میزبان می‌تواند در محیط رهاسازی شود. در واقع LPS به دلیل توانایی تحریک انواع اثرات بیولوژیکی در پستانداران و همچنین در تولید سایتوکاین‌های پیش التهابی همچون فاکتور نکروز دهنده تومور-α (TNF-α) و اینترلوکین‌ها، به نام اندوتوکسین خوانده می‌شود. تولید این میانجی‌ها در غلظت‌های پایین اندوتوکسین ممکن است منجر به اثرات بیولوژیکی مفید شوند ولی در غلظت‌های بالاتر، رهاسازی سایتوکاین‌ها می‌تواند منجر به
سمیت خود بدن و در نتیجه ایجاد سندروم شوک شود. LPS شامل یک بخش قندی با شاخه‌هایی با اندازه‌های مختلف از پلی ساکارید (آنتی‌ژن O) تا الیگوساکارید که این وابسته به گونه‌های باکتریایی و یا موتانت‌های باکتریایی (فرم صاف LPS تا فرم زبر LPS) است و به صورت کوالان به قسمت هیدروفوبیک LPS یعنی لیپید A متصل می‌شود که آن هم در اتصال مولکول LPS به غشا نقش دارد (18). شکل 2-1. ترکیب غشای باکتری‌های گرم منفی غشای سیتوپلاسمی‌یا غشای داخلی، سلول باکتری را احاطه می‌کند. پری پلاسم که دارای پپتیدوگلیکان می‌باشد توسط غشای خارجی احاطه می‌شود. لیپو پلی ساکارید در لایه‌ی بیرونی غشای خارجی قرار دارد و حاوی 3 جزء متمایز لیپید A، مرکز الیگوساکاریدی و آنتی ژن O است. مرکز الیگوساکاریدی شامل یک تک قند به نام 2- کتو-2- دئوکسی اوکتونات (KDO) است (18).
2-1-2. ساختار لیپو پلی ساکارید
دسترسی به LPS خالص امکان مطالعه‌ی اجزای آن را به صورت جداگانه فراهم آورده است. خانواده‌ی انتروباکتریاسه (باکتری‌های بیماریزا و غیر بیماریزای گوارشی) از جمله سالمونلا و اشریشیا از نخستین باکتری‌هایی بودند که LPS آنها به صورت شیمیایی مورد بررسی قرار گرفت. مورفولوژی کلونی همه‌ی تیپ‌های وحشی استرین‌های این باکتری‌ها شبیه هم‌اند که کامل و صاف هستند (به جز برخی از موتانت‌ها که کلونی‌های زبر با لبه‌های نامنظم دارند). پیشنهاد لودریتز بعد از مطالعه‌ی صد‌ها LPS انتریک این بود که تمام اندوتوکسین‌ها ترکیبی از 3 اجزای عمومی‌هستند: انشعاب اختصاصی O، مرکز الیگوساکارید و لیپید A. شکل 2-2. ساختار LPS از نوع صاف نشان دهنده‌ی انشعاب اختصاصی O، مرکز داخلی و خارجی، لیپید A می‌باشد (18).
(KDO 2- کتو-2- دئوکسی اوکتونات: ؛Hep:هپتوز ؛Hexهگزوز: ) همان طور که ذکر شد LPS از 3 ناحیه که به صورت کوالانت به هم متصلند تشکیل شده است. ناحیه لیپید A یا اندوتوکسین A در غشای خارجی مانند لنگری هیدروفوبیک عمل می‌کند و دارای فعالیت توکسینی است. ناحیه هسته، الیگوساکاریدی فسفریله شده است و در برابر آنتی‌بیوتیک‌ها در غشا خارجی به عنوان سد عمل می‌کند. ناحیه پلیمری آنتی‌ژن O الیگوساکاریدی ایمونوژنیک است که از واحد‌های قندی تکرار شونده تشکیل شده است. این واحد‌ها در گونه‌های مختلف و نیز از سویه‌ای به سویه‌ی دیگر متفاوتند. ناحیه‌ی لیپید A در تمام باکتری‌های گرم منفی یکسان است یا تفاوت اندکی دارد. ناحیه درونی هسته در محدوده وسیعی از گونه‌های باکتریایی یکسان است و در مواردی درجات محدودی از تمایز را نشان می‌دهد. اما ساختمان آنتی‌ژن O به طور قابل توجهی در باکتری‌های گرم منفی متفاوت است که پایه مهمی‌ برای تشخیص و تعیین گونه و سویه‌های باکتری‌های گرم منفی است. کلنی باکتری‌های گرم منفی بر حسب شکل ظاهری خود به دو فرم زبر (R)11 و نرم (S)12 تقسیم می‌شوند. در فرم S مولکول LPS به طور کامل بروز می‌کند در صورتی که در فرم R مولکول LPS فاقد آنتی‌ژن O به طور کامل است (6). شکل 2-3. ساختار LPS از نوع زبر. پلی ساکارید اختصاصی O شامل تعداد مختلفی از واحد‌های تکراری پنتا ساکارید است. Hep: L- گلیسرو- D- مانو- هپتوز، Gal: گالاکتوز، Glc: گلوکز، GlcN: گلوکزآمین، GlcNAc: N- استیل گلوکزآمین، Kdo: 3- دئوکسی- D- مانو- اوکت-2- اولوسونیک اسید،L-Ara4N: 4- آمینو-4-دئوکسی-L – آرابینوز (6). 2-1-2-1. آنتی‌ژن O (شاخه‌ی اختصاصی O):
مطالعات نشان می‌دهند که آنتی‌ژن- O یک پلی ساکارید پیچیده است که حاوی واحد‌های تکراری 5 تا 8 مونوساکارید (گالاکتوز، رامنوز، مانوز و آبکوز در سالمونلا تیفی موریوم) می‌باشد. گونه‌های مختلف سالمونلا دارای انواع مختلفی از آنتی‌ژن‌های O هستند و آنتی سرمی ‌که ضد هر گونه از آن ایجاد می‌شود هیچ گونه واکنش متقاطعی با گونه‌ی دیگر ندارد. این یافته‌ها در طبقه‌بندی باکتری‌ها به سروتیپ‌ها که توسط کافمن، لودریتز و وستفال در سال 1960 میلادی پایه‌گذاری شد مؤثر بود. آنتی‌ژن O دارای فعالیت‌های بیولوژیکی متعددی همچون عرضه رسپتور برای باکتریوفاژ‌ها، تنظیم فعالیت مسیر آلترناتیو کمپلمان و مهار اتصال کمپلکس اتصال شونده به غشا به غشای خارجی باکتری است (77 و 64).
2-1-2-2. الیگوساکارید مرکزی
در سال‌های بعد مشخص شد که همه‌ی باکتری‌های گرم منفی دارای آنتی‌ژن O نیستند. این دسته از باکتری‌ها را با نام زبر (R) می‌خواندند چون کلونی‌هایی ناقص و ضخیم در روی آگار جامد تشکیل می‌دادند و در سالین اتوآگلوتیناسیون نشان می‌دادند. مطالعات در محور الیگوساکارید مرکزی با شناسایی موتانت‌های سالمونلا مینسوتا13 و سالمونلا تیفی موریوم14 فراهم شد. موتانت‌های زبری که تمام قسمت مرکزی را سنتز کنند ولی فاقد آنتی‌ژن O باشند را با نام Ra می‌شناسند و آنهایی که فاقد قند مرکزی باشند با نام Rb و موتانت‌هایی که دارای کوتاهترین قسمت مرکزی باشند را با نام Re می‌خوانند. اگر چه ناحیه‌ی مرکزی در میان گونه‌های باکتریایی فرق می‌کند ولی همه‌ی این نواحی‌ها دارای قند غیر معمول 2- کتو-3 – دئوکسی اوکتونات (KDO) هستند. از دیگر رزیدو‌های آن می‌توان به هپتوز، گلوکز، گالاکتوز و N- استیل گلوکز آمین اشاره کرد. حداقل میزان لازم برای بقای سلول، یک تک مولکول KDO می‌باشد که در LPS سالمونلا و اشریشیا کلی نوع Re حضور دارد. با توجه به شدیدترین موتانت یعنی Re می‌توان استنباط کرد که KDO باید مستقیماً به لیپید A متصل شده باشد. در مورد فعالیت بیولوژیکی ناحیه‌ی مرکزی بیرونی LPS یافته‌های
زیادی وجود ندارد اما اعتقاد بر این است که هر دو مرکز بیرونی و درونی حامل اپی توپ‌هایی برای آنتی‌بادی هستند.
2-1-2-3. لیپید A
وستفال و لودریتز با کشف لیپید A اعتبار زیادی به دست آوردند. آنها در سال 1954 میلادی ساختار لیپیدی محلول در پیریدین و کلروفرم را از LPS و توسط تیمار آن با HCl به مدت 30 دقیقه و در دمای بالا خالص‌سازي کردند. تعیین ساختار لیپید استخراج شده نسبت به ناحیه‌ی مرکزی و آنتی‌ژن O مشکل بود، تا زمانی که تاکایاما ساختار کامل و صحیح لیپید A را در سال 1983 بیان کرد. در حال حاضر می‌دانیم که لیپید A دارای یک ستون دی گلوکز آمینی است که حاوی اتصالات β(1-6) می‌باشد. دو گروه فسفات در جایگاه 1 و 4 به این ستون وصل می‌شوند. این فسفات‌ها اغلب با گروه‌های قطبی مثل 4- آمیتو- 4- دئوکسی-L- آرابینوز و یا اتانول آمین تغییر می‌یابند که هر دو با تیمار اسید ملایم حذف می‌شوند تا تخلیص و مطالعه LPS صورت گیرد. برای اولین بار]]>